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本制品为碱性磷酸酶活性检测试剂盒，可快速、便捷地检测细胞或组织裂解液/匀浆液、血清、血浆、尿液、纯化酶等样品中的ALP活性。该试剂盒包括标准品和空白对照，可进行达100个样品的检测。

对硝基苯磷酸(p-nitrophenyl phosphate,pNPP)是一种常用的磷酸酶显色底物，碱性条件下，可在ALP作用下生成对硝基苯酚(p-nitrophenol,pNP)，后者在碱性环境下呈黄色产物，并在405nm处可检测到最大吸收峰。产物黄色越深，说明ALP活性越高，反之则活性越低。因此，通过检测OD405吸光值即可计算ALP活性水平。


碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，简写为ALP或AKP)，又称碱性磷酸酯酶，是一组同工酶，目前已发现六种ALP1-ALP6。广泛分布于人体肝脏、骨骼、肠、肾和胎盘等组织，是经肝脏向胆外排出的一种酶。碱性条件下可催化磷酸酯键的水解，从而将底物分子上的磷酸基团去除，转化为羟基。此类底物包括核酸(DNA、RNA)、蛋白、生物碱等。常见的有肠道碱性磷酸酶、非组织特异性碱性磷酸酶、胎盘碱性磷酸酶等；生物学中碱性磷酸酶(ALP)水平的变化及其活性的高低常被作为一种检测组织行为的指标，如：

• 作为iPS成功诱导的标志；ALP在大多数细胞类型中均有表达，但是在iPS细胞内的表达水平明显升高；
  
• 结肠癌细胞分化程度定性和定量的指标；
  
• 血清中碱性磷酸酯酶的升高可导致高碱性磷酸酶血症，常被认为和恶性胆管阻塞，原发性硬化胆管炎，肝癌，肝硬化等肝胆疾病密切相关；
  
• 血清中碱性磷酸酶活性升高还和骨骼损伤导致的骨生成，以及骨骼疾病如纤维骨炎、佝偻病、成骨不全等密切相关；
  
• 碱性磷酸酶水平也会出现一些病理性降低的情况，多见于重症慢性肾炎、儿童甲状腺机能不全、贫血等。对于正常成人来说，血清内ALP的范围为40～150U/L。

组分	规格
ALP反应缓冲液	15mL
显色底物	2管
pNP标准品溶液	100μL (10mM)
反应终止液	12mL

保存：-20℃，有效期1年，其中显色底物、pNP标准溶液需要避光保存。

• 如果进行酶活力的绝对定量，进行酶反应时必须注意精确计时。此时推荐孵育30min等较长时间，以减小操作过程中的时间误差。如果样品中酶活性较高，则可以预先适当稀释样品。
  
• 样品溶液中须避免出现EDTA、氟离子、柠檬酸盐等碱性磷酸酶抑制剂。
  
• ALP反应缓冲液和p-nitrophenol标准品溶液对人体有害，请注意适当防护。反应终止液有腐蚀性，请小心操作。
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
  
• 本制品仅作科研用途！

• 试剂准备：
  将所有试剂取出，恢复至室温使用。
  
  • 显色底物溶液：取一管显色底物，溶解于2.5mL的ALP反应缓冲液中，充分溶解和混匀，冰上放置。注意：新鲜配制的显色底物溶液需在数小时(≤ 6h)内使用。
    
  • 标准品工作液：取10μL p-nitrophenol标准品溶液(10mM)，用ALP反应缓冲液稀释至0.2mL，使得终浓度为0.5mM。
• 样品准备：
  
  • 细胞或组织裂解液的准备：采用适当细胞或组织裂解液裂解细胞和组织，如果有必要需进行适当匀浆，随后离心取上清，用于ALP活性的检测。
    注：裂解液中不能含有磷酸酶抑制剂。样品可以-80℃冻存，避免反复冻融。
    
  • 血浆、血清和尿液的准备：血浆和血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定，但为了消除样品本身颜色的干扰，需设置加了血浆或血清但不加底物的对照。
    注：血浆制备不能用含EDTA和柠檬酸盐的抗凝管。尿液通常也可以直接用于测定。上述样品可以-80℃冻存，避免反复冻融。
    
  • 样品的稀释：若样品中含有较高活性的ALP，可以使用原有的裂解液或PBS等进行稀释，也可以采用试剂盒中的ALP反应缓冲液进行稀释。若使用上述反应缓冲液进行稀释，需保留足够的缓冲液用于试剂盒的检测过程。
• 加样：
  参考下表使用96孔板设置空白对照孔、标准品孔和样品孔。标准品的用量分别为4、8、16、24、32和40μL，样品通常可以直接加50μL。如果样品中的碱性磷酸酶活性过高，可以减少样品用量或适当稀释后再进行测定。
  表1：各组分加样数据表
  

  成分	空白对照(Blank)	标准品(Standard)	样品(Sample)
  ALP反应缓冲液	50μL	(100-x)μL	(50-y) μL
  显色底物	50μL	－	50μL
  样品	－	－	yμL
  标准品工作液	－	xμL	－

  
  
• 混匀：用枪头轻轻吹打混匀，也可借助摇床进行混匀。
  
• 孵育：37℃孵育5～10min。(待测样品中ALP活性较低时，可适当延长孵育时间至30min)
  
• 终止：每孔加入100μL反应终止液终止反应。此时，标准品或有ALP活性的孔会呈现不同深浅的黄色。
  
• 检测：405nm测定吸光度。如果不能测定405nm，也可以在400～415nm范围内检测吸光度。如果不能立即测定，可以在数小时内完成测定，所显现的黄色在数小时(≤ 6h)内稳定。
  
• 结果分析：
  碱性磷酸酶活性单位的定义：在pH9.8的二乙醇胺(diethanolamine，DEA)缓冲液中，37℃条件下，每分钟水解pNPP显色底物产生1μM p-nitrophenol所需的ALP量定义为一个酶活力单位，也被称作一个DEA酶活力单位。在pH9.6的甘氨酸缓冲液中，25℃条件下，每分钟水解pNPP显色底物产生1μM p-nitrophenol所需的ALP量定义为一个酶活力单位，也被称作一个甘氨酸酶活力单位。一个甘氨酸酶活力单位约相当于3个DEA酶活力单位。本试剂盒测定的是DEA酶活力单位。最后，根据酶活性单位的定义，计算出样品中的碱性磷酸酶活性。

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